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蛋白纯化常见问题
2015-8-18
来源:互联网
点击数: 2612          作者:未知
  • 1、HIS标签蛋白洗脱后杂带较多,什么原因? 如何优化?

    高纯度的蛋白是纯化工作者的追求,但是由于很多天然的蛋白也会带有HIS,所以经常会出现HIS标签蛋白洗脱后有一些杂带,可能的原因和优化的方法如下:

    可能原因:蛋白酶部分降解了标签蛋白

    策略:请添加蛋白酶抑制剂,(慎用EDTA)。 

    可能原因:杂质对镍离子有更高的亲和性

    策略1:咪唑浓度必须优化,以确保高纯度(宿主细胞蛋白质的低结合)和高产率(组氨酸标记的目标蛋白质的强结合)之间的******平衡。分步或者线性洗脱摸索出******的咪唑结合和清洗浓度;在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑;咪唑的梯度不大(20 个或更多的柱床体积),可能分离出有相似结合强度的蛋白。

    策略2:筛选最适合的缓冲液条件,NaCl浓度,pH的范围都需要进行筛选以下是(His)6-NuRR1蛋白在His MultiTrapFF96孔板上进行缓冲液条件的筛选以便决定最适的结合和洗脱条件。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时,将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成96个不同的混合配方。实验结果显示对于该目标蛋白25mMTris,10mMNaCl,10%甘油,pH8.5的缓冲液适******的结合条件。

    策略3:若以上优化的条件都不能去除杂质蛋白,需要考虑多步纯化的思路,离子交换(HiTrap Q HP or HiTrap SPHP) 和凝胶过滤(Superdex™Peptide,Superdex 75 or Superdex200)是必须的.以下是用ÄKTAxpress仪器进行四步纯化的实例。AC(亲和),DS(脱盐),IEX(离子交换),GF(凝胶过滤)所有的步骤都在ÄKTAxpress上自动执行,包括柱上的标签酶切。

    可能原因:杂质和标签蛋白结合在一起

    策略:在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂;增加去垢剂的浓度,( 2 % Triton X-100 or 2 % Tween 20);或者在wash buffer中增加甘油的浓度(50%)减少非特异性的相互反应;考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子。

    可能原因:洗涤不充分

    策略:增加洗涤的次数,使洗涤充分。

    2、对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品,有哪些样品处理的方法?

    在纯化前,合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱,延长使用寿命。对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂蛋白,酚红,小分子污染物等等。 腹水中经常含有高浓度的脂蛋白,这些脂蛋白和脂类物质会堵塞层析柱,******能在纯化之前去除。方法一是在二价离子存在的情况下,硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白,沉淀可以通过离心除去;方法二PVP能产生一个pH值依赖的沉淀效应,PVP在pH=7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球蛋白。很多时候,可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释腹水,不仅保证样品的结合pH,还有利于降低黏度。 酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂,虽然并不直接的影响纯化,但是酚红可能结合到某些纯化介质上,应该尽可能早的被除去,可以使用脱盐柱除去酚红。 对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除,如硫酸铵沉淀,羊脂酸沉淀的方法。 ******利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐,,把样品换到合适的缓冲液中(PH和盐浓度),并除去没有用处的小分子。

    3、为什么洗脱之后没有看到正确的条带?

    首先我们先看样品是否结合了?先查不同的种属亚型参考“相对结合强度”表(图1),看有没有亲和性,柱子选得对不对。然后检查结合缓冲液和样品的pH是否7.3附近。必要时将原始样品和流穿跑还原和非还原SDS-PAGE进行分析,有条件可以做Western Blot,或检测Elisa是结合上去没有洗脱?

    检查洗脱缓冲液pH对否?

    建议依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脱,跑电泳或ELisa等检测洗脱产物

    洗脱峰是否立即中和?

    蛋白长期在酸性条件下易水解,中和后也容易产生沉淀

    跑电泳的loading buffer是否新鲜配置?(常遇到还原loading buffer中DTT失效,导致电泳条带位置不对)

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