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竞争Elisa:间接法与直接法的差异
2015-12-9
来源:丁香园论坛
点击数: 3722          作者:象棋筛子
  • 一、定义
        间接竞争法的模型:包被抗原,用HRP-抗体与样本一起加入。样本中的Ag与Solid-Ag竞争HRP-Ab,固相吸附的HRP-Ab与样本中的Ag浓度成反比。
        直接竞争法的模型:包被抗体,用HRP-抗原与样本一起加入。样本中的Ag与HRP-Ag竞争Solid-Ab,固相吸附的HRP-Ag与样本中的Ag浓度成反比。
    二、竞争法的理论基础:是限量抗体。只有在限量抗体基础上,两种抗原才会形成竞争关系。
    三、间接竞争法具备较高灵敏度原因。
        直接竞争法里,标记抗原与待测抗原均是液相,与抗体的结合机会是一样的,例如有1份标记抗原与1份待测抗原竞争1份抗体,那么有50%的标记抗原能与抗体结合,所以标记抗原的相对结合率为50%。间接法里,固相抗原与抗体的接触面积较小,固相抗原与待测抗原的结合抗体机会是不平等的,接近顺序饱和法,即只有与待测抗原结合剩余的抗体才会与固相抗原结合,同样有1份固相抗原与1份待测抗原竞争1份抗体时,基本上抗体会被待测抗原中和掉,与固相抗原结合的抗体非常少。固相抗原的相对结合率为0%。因此,间接法的抑制曲线斜率会大于竞争法。


        因为抑制率越大则斜率越大,从而灵敏度越大。(假设零管变异5%,以两倍SD为灵敏度限,则为90%相对结合率,则间接法可以在较低的待测抗原浓度达到这一相对结合率,因此灵敏度要高。)
    在进行系统放大时,间接法一般可以使用酶标二抗。因为二抗可以针对抗体的多个部位,所以存在放大效应,从而能提高间接法的灵敏度。直接法一般难以进行放大,常用的有生物素化抗原与酶标亲和素,但模式上似乎不存在放大效应。
    四、间接法的高灵敏度难以实现的原因:
        双抗体夹心的免放(IRMA)模式刚出现时,也被模型证明灵敏度优于竞争法的放免(RIA),原因也是较大的斜率,但是IRMA的高灵敏度一直到单抗发展后才得以实现。间接法的高灵敏度也有其实现的条件,其中有几点最为可疑:
        固相抗原与液体抗体的结合位点问题。很多时侯小分子直接包被或多肽包被后与液体抗体结合位点受到干扰,亲和力下降。一般小分子必须衍生后进行包被,但仍可能导致亲和力的下降。固相抗原与液体抗体的接触面积较少,因此需要更长时间去达到平衡。竞争法的基础在于限量抗体,即两种抗原竞争有限抗体。在间接法里,由于抗原与抗体结触面较少,除非无限延长时间,否则可能只有较少的抗体能被固相抗原捕获,从而导致最终固相化的酶数量较少,最终的吸光度变低。而在直接法里,虽然接触面是一样的,但所有的抗体都在接触面上参与反应,所以最终固相化的酶要多一些。3)直接法时抗体先固相化,一般是FC结合聚苯乙烯,针对不同抗原位点的抗体都能与标记抗原反应。因此,参与竞争的是针对所有位点的多抗。而间接法时,固相抗原的位点受到影响,部分抗原位点会消失。这时侯,针对这些位点的抗体将只与待测标本中的抗原反应。待测标本中的抗原需要先将这些抗体中和掉,剩余的抗原再与固相抗原竞争剩余的抗体。通过筛选与固相抗原结合力不变的单抗可以解决这一问题。象棋筛子象棋筛子

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