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PCR 片段的克隆方案集锦
2015-8-18
来源:互联网
点击数: 2993          作者:未知
  • PCR 扩增后的产物往往要克隆到载体中,传统的克隆方法主要有限制性酶切与连接法和 TA 克隆法。由于在 PCR 片段的两端酶没有足够的空间和其结合,因此 PCR 片段的酶切比质粒酶切要困难的多。为了把 PCR 片段克隆到其他的另外的载体中,******步是把 PCR 片段克隆到 T vector 或 pUC18 这样的 PCR 克隆载体中。但是 TA 克隆的缺点也很明显,诸如需要单独购买 T 载体,连接效率不高,需要进行亚克隆等。

    如何把 PCR 片段直接克隆到一个克隆载体中?

    有时需要把 PCR 片段直接克隆到一个克隆载体中。PCR 片段和载体使用同样的酶进

    行酶切。把经过酶切的 PCR 片段和经过酶切的载体连接起来。

    要使这种酶切和连接的成功率更高,以下几点非常重要:

    – 设计引物时需要加保护碱基。

    – PCR 片段酶切需要的时间可能比质粒酶切时间长。

    – 如果直接克隆很困难,可以先 PCR 片段克隆到 T vector 或 pUC18 这样的 PCR克隆载体中,然后再克隆到另外的载体。

    – 为了节省时间,明智的选择是克隆到 T vector 或 pUC18 这样的 PCR 克隆载体和克隆到另外的载体同时进行。

    – 片段与载体的量要足够.

    如何更换载体?

    在做克隆之前,作酶切位点的分析很重要:

    – 用于克隆的酶在目的载体和基因片段都必须是******的。

    – 请检查要使用的酶切位点在目的载体的位置。如果两个酶切位点挨的很近,先进行一个酶切,再进行另一个酶切很必要。也就是说,先用******个酶切质粒,进行完胶回收后再进行第二个酶切。

    – 酶切要使用足够量的质粒:有足够的质粒用于酶切和胶回收很重要。一个克隆培养 15mL 培养基,小量抽提质粒可以获得足够质粒。

    – 如果使用的酶对于目的质粒没有切开,可以用这个酶切一下 pUC18 以便检查这个酶是否好用。如果这个酶能酶切 pUC18 而不能酶切你的目的质粒,解决办法是重新制备你的目的质粒。如果这个酶不能酶切 puc18,解决办法是从另外的公司重新定购这个酶。

    如何观察阳性克隆?

    在作克隆时,同时作一个阴性对照很重要。例如作连接时,载体自连作一个,插入片段自连作一个。

    理想的情况应该是这样的:

    – 如果在阴性对照的平板上长 10-20 个克隆。而在你连入片段的平板上长超过40 个克隆。在这种情况下,挑选一些克隆作检测,就可以挑选出阳性克隆了。

    – 如果在阴性对照的平板上没有长克隆,就有些麻烦了,有可能酶切时间过长,导致酶切和连接失败。

    酶切克隆:

    尽量使用相同公司的酶,先低盐后高盐,Buffer 控制在活力 50%以上,尽量考虑通用Buffer。

    所有的限制性内切酶切割 DNA 均产生含 5′磷酸基和 3′羟基基团的末端。有些酶能使其识别序列相对两链之间的数个碱基对(base pairs)分开,形成 5′末端突出的粘性末端。还有一些酶产生具有 3′末端突出的粘性末端。如图所示

    EcoRI5′-G▼AATT C-3′      MunI5’-C▼AATTG-3’

    3′-C TTAA▲G-5′        3’-GTTAA▼C-5’

    而另有一些酶切割 DNA 后产生平头或钝性末端(blunt end),如HpaI: 5′- GTT▼AAC -3′     SmaI: 5′- CCC▲GGG -3′EcoRV: 5′- GAT▲ATC -3′

    3′- CAA▲TTG -5′3’     - GGG▲CCC-5’       3’- CTA▲TAG-5’

    有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割 DNA 后产生相同类型的粘性末端,称配伍末端(compatible end),可进行相互连接;产生平端的酶切割 DNA 后,也可彼此连接。

    TA 克隆

    原理:应用了 taq DNA polymerase 的扩增特性,在扩增后的片段尾部自动加一个 A,根据碱基配对原则,人为设计出末端含有 T 的载体,AT 配对,在 T4 DNA ligase 的作用下,把片段和载体连接在一起。PCR 片段克隆到 T vector 克隆载体:T vector 在载体的两端各有一个突出的 T。如果扩增 PCR 片段使用的是 Taq 酶,那么扩增出的 PCR 片段在其两端都有一个突出的 A。这样 T vector 和 PCR 片段的 TA 碱基配对就很容易克隆。

    每个人掌握 PCR 片段克隆到 T vector 克隆载体这个技术是很重要的。但是请记住如果扩增 PCR 片段使用的是 pfu 等具有外切酶活性的酶,克隆到 T vector 不适用。

    平末端克隆

    首先将载体线性化,然后 CIAP 去磷酸化处理。 连入片段。克隆方向和载体自连问题比较突出。

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