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真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体
2015-8-18
来源:互联网
点击数: 2791          作者:未知
  • 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。

    自上世纪70年代基因工程技术诞生以来,基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行,在技术方法上得到了很大发展,时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成,越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。

    在各种表达系统中,最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌),通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应,目的蛋白常以包涵体形式表达,导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低。

    为克服上述不足,许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是:

    ① 根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制;

    ② 能诱导基因高效表达,可达105倍,为其他系统所不及;

    ③ 能严格调控基因表达,即不仅可控制基因表达的“开关”,还可人为地调控基因表达量。

    因此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

    1、酵母表达系统

    最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等,其中,甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha,Candida Bodini,Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。

    甲醇酵母的表达载体为整合型质粒,载体中含有与酵母染色体中同源的序列,因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0x1),在该基因的启动子(PAXOI)作用下,外源基因得以表达。PAXOI是一个强启动子,在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOx1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为******碳源时PAXOI可被诱导激活,因而外源基因可在其控制下表达,将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为E.coli/Pichia Pastoris的穿梭载体,其中含有E.coli复制起点和筛选标志,可在获得克隆后采用E.coli细胞大量扩增.目前,将质粒载体转入酵母菌的方法主要有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞,不会发生超糖基化。

    利用PAXOI表达外源蛋白时,一般需很长时间才能达到峰值水平,而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。使得实验操作过程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产。因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多种。利用三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子代替PAXOI,不需要甲醇诱导。培养过程中无需更换碳源,操作更为简便,可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间。

    酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统,由于兼具原核以及真核表达系统的优点,正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。

    2、昆虫细胞表达系统

    杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统,该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)作为表达载体。在AcNPV感染昆虫细胞的后期,核多角体基因可编码产生多角体蛋白,该蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体。核多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力,故常被用来构建杆状病毒传递质粒。克隆入外源基因的传递质粒与野生型 AcNPV共转染昆虫细胞后可发生同源重组,重组后多角体基因被破坏,因而在感染细胞中不能形成包涵体,利用这一特点可挑选 出含重组杆状病毒的昆虫细胞但效率比较低,且载体构建时间长,一般需要4~6周。此外,昆虫细胞不能表达带有完整N联聚糖的真核糖蛋白。

    在病毒感染晚期,由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解,胞质内的物质释放出来,与 目的蛋白混在一起,从而使蛋白的纯化工作变得很困难,另外水解酶的释放会降解重组蛋白。为了克服以上这些困难,科学工作者先后尝试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒ie-1基因启动子表达外源蛋白,但效果都不明显。Farrel等介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统,该系统主要包括3个调节外源蛋白表达序列:

    (1)Bombyx mori的肌动蛋白基因启动子;

    (2)Bombyx mori的核型多角体病毒(BmNPV)的立早基因ie-1(编码俄IE-1蛋白,该蛋白是种转录激活因子,可在体外激活肌动蛋白基因启动子);

    (3) BmNPV的同源重复序列3(HR3)可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。三者协同作用,可使转录活性提高 1000倍以上,从而大大地提高外源蛋白的表达水平。另外目前还有一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒(HyNPV)被应用于昆虫细胞表达系统的构建,该病毒由AcNPV及 Bni'qP发展而来。

    一般情况下杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的,大部分为非分泌性。为了解决这个问题将Hsp70(热休克蛋白70)与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平,这是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才能被分泌至胞外。如果到达内质网前,前体多肽就伸展开来,暴露出疏水残基,残基间的相互作用可引起多肽的凝聚,这对最终的表达水平有很大影响。而Hsp70是一种分子伴侣,能够与新翻译的多肽结合,抑制前体肽的凝聚使前体肽顺利到达内质网进行加工,从而提高蛋白的分泌水平。

    最近,人们又构建了杆状病毒-S2表达系统,该系统能将重组杆状病毒转染果蝇S2细胞,以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目昆虫细胞(如 sf9、sf21)中复制,不能在其他昆虫细胞(如果蝇细胞)中复制,然而目前研究表明在一定条件下,杆状病毒也能感染果蝇细胞。在果蝇细胞中,杆状病毒的多角体基因启动子几乎不发生作用。杆状病毒-S2表达系统的表达载体利用的是果蝇启动子如Hsp70启动子、肌动蛋白5C启动子、金属硫蛋白基因启动子等,其中,Hsp70启动子的作用最强。重组杆状病毒感染S2细胞后不会引起宿主细胞的裂解,且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似,因此,杆状病毒-S2系统是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。昆虫细胞表达系统,特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全,表达量高,目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。

    3、哺乳动物细胞表达系统

    由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质,在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统,更接近于天然蛋白质。哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。

    将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法 :一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞,二是通过脂质体法、显微注射法 、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。外源基因的体外表达一般采用质粒表达载体,如将重组质粒导入CHO细胞可建立高效稳定的表达系统,而利用COS细胞可建立瞬时表达系统。目前,病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具,在临床基因治疗的探索中也发挥了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相当大(约187kb),利用它作为载体可同时插入几种外源基因,从 而构 建多价疫苗。另外,逆转录病毒感染效率高,某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因,但要注意的是逆转录病毒可整合入宿主细胞染色体,具有潜在的危险性。

    由于腺病毒易于培养、纯化,宿主范围广,故采用该类病毒构建的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装载体之间的同源重组。但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低,利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高,即将外源基因插入到腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒,将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希菌。另一种方法是通过CrelaxP系统构建重组腺病毒载体,在转移质粒和包装质粒中都插入laxP位点,然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞,通过Cre介导两个laxP位点之间的DNA发生重组,可获得重组腺病毒,这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。最近,人们在杆状病毒中插入巨细胞病毒的启动子建立了高效的基因转移载体。由于杆状病毒是昆虫病毒,在哺乳动物细胞中不会引起病毒基因的表达,而且载体的构建容易,因而利用杆状病毒进行基因转移为我们提供了很好的途径。

    利用哺乳动物细胞表达外源基因时,大多数情况下不需要诱导,但当表达产物对细胞有毒性时应采取诱导,这样可避免表达产物产生早期就对细胞产生影响。哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导,还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子。但这些系统存在一些共同的缺陷,如诱导表达特异性差;当系统处于关闭状态时表达有泄漏诱导剂本身有毒性,常对细胞造成损伤等。

    为此,Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on基因表达系统,该系统由调节质粒和反应质粒组成。调节质粒中具有编码转录激活因子(fIA)的序列,在没有四环素或强力毒素存在的情况下 tTA可引起下游目的基因表达。随后Gossen等又对tTA的氨基酸序列进行了改造,构建了受四环素正调节的Tet-on基因表达系统,该系统在没有四环素的情况下启动子不被激活,而在加入四环素或强力毒素后目的基因高效表达。四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统,该系统具有严密、高效可控制性强的优点。

    外源蛋白的表达会对哺乳动物细胞产生不利影响,因此利用哺乳动物细胞表达外源基因时,一个主要问题便是外源基因不能持久稳定地表达。Mielke等构建了一种能够在哺乳动物中稳定表达异二聚体蛋白的载体系统,在这个系统中,编码抗体重链和轻链的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被转录成三顺反子mRNA。内部的顺反子通过内核糖体进入位点(IREs)介导进行翻译,通过持续选择压力,无需繁琐的筛选过程,便可获得持久、稳定表达抗体分子的重组体。

    哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等,不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响,因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。

    利用基因工程技术表达外源蛋白。其产量还不高,难以满足大规模的实际应用。通过转基因动物或转基因植物技术可从动物的乳汁或植物的叶组织中很方便地获得大量较纯的生物活性物质,但目前这项技术还不很成熟,有待进一步研究。

    4、结语

    目前已经建立了多种诱导表达系统,但它们都有其优点和不足,这就需要我们根据自己的要求选用适当的表达系统。一般来说,一个理想的可诱导表达系统需要符合下述几个方面的要求:

    特异性:该系统不受其他内源因素的影响,仅能被外源的非毒性药物所活化。

    非干扰性:该系统成分不能对细胞通路有干扰。

    可诱导性:该系统在非活化状态下本底活性******,而在活化状态下能快速产生高水平的基因表达。

    诱导剂的生物利用率:调节分子能快速渗透人各组织,能通过胎盘屏障及血脑屏障。

    可逆性:诱导剂能快速被各组织清除使该系统很快恢复非活化状态。

    剂量依赖性:该系统的反应与诱导剂的浓度成正比,以便进行定性定量分析。

    总之,各种表达系统各有其优缺点,酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高,生产成本低,但它们的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同;哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质,但其表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同,因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。Van der GeId等利用不同的表达系统表达了蛋白激酶(PR30),并对它们的抗原性进行了比较,结果发现,在哺乳动物细胞中表达的PR3具有与抗PR3抗体结合的所有表位,在昆虫细胞中表达的PR3具有大部分表位,而在 甲醇酵母中表达的PR3只具有少数几个表位。因此,选择表达系统时,必须充分考虑各种因素,如所需表达的蛋白质性质、实验条件、生产成本、表达水平、安全性等,权衡利弊后再选择相应的表达系统。

    真核细胞常见表达载体

    (1)pCMVp-NEO-BAN载体

    特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成, 在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后,用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

    插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

    (2)pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)

    特点:   pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

    用途:该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。 借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

    亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

    3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体

    特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

    用途:pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白,该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白,因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。

    4、pSV2表达载体

    特点:该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的,克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因,故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。

    5、CMV4 表达载体

    特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动,多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是,该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。

    其他常用克隆Vector:

    pBluscript II KS DNA 15 ug

    pUC18 DNA 25 ug

    pUC19 DNA 25 ug

    说明:

    pBluescript II kS、pUC18 & Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点,当外源DNA片段扦入,转化lacZ基因缺乏细胞,并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时,含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落,而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落,由此易于筛选有无外源DNA片段的载体。此外,这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。

    保存液:TE Buffer

    TE Buffer组成:

    10mM Tris.HCL(Ph 8.0)

    1mM EDTA

    用途:

    克隆外源DNA片断.

    进行基因表达.

    使用M13、T7和T3引物进行测序.

    存在的问题

    细胞的生命活动是一个复杂的调控过程,有些生命活动的机理还不完全清晰,由于插人的目的基因不同,载体构建栗用的顺式组件不同,组装的空间位置不同,采用的表达系统不同,目的基因表达水平和阳性克隆筛选率都会有很大差异。另外,由于所有的顺式元件存在种属和组织特异性,所构建的高效表达载体不一定在所有细胞株中均高效表达。再者,细胞生长状态的差异,转染方法的不同培养时阉的长短,筛选药物浓度的高低,对表达量都有很大影响。所以,需要综合评价一个表达载体和表达系统,排除一些不定因素,筛选出******组合

    真核表达载体趋向于既有利于扩增目的基因又有利于筛选阳性克隆的载体的构建。许多有效的应用范围广的强启动子和增强子被人发现并应用于载体中,大大提高了目的基因的表达量,另外一些强的组成型启动子,如 SV40早期启动子+PHTLv,已应用于大规模生产的细胞系中。

    应用以GS为筛选标志的表达载体可兼有筛选和扩增目的基因两种功能,是目前研究的重点。以IRES连接的双顺反子表达载体已成为核表达载体的主体。在同一启动子操纵下,筛选基因或报告基因与目的基因转录在同一mRNA上通过 IRES的作用,表达出两种蛋白,因而在理论上可认为,通过了筛选或表达了报告基因的克隆必为阳性克隆,即表达目的基因的克隆,有报道说这种双顺反子的共表达率为90%。这就大大提高了筛选率,简化了实验过程。

    将强启动子、增强子和可扩增的筛选标志组装在同一载体上,构建高效表达和筛选的表达载体并将其运用于最合适的表达系统中,是当今真核表达载体构建研究发展方向。

    真核细胞表达系统主要包括酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。真核细胞常见表达载体为:pCMVp-NEO-BAN载体、pEGFP,增强型绦色荧光蛋白表达载体、pEGFT-Actin 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体、pSV2表达载体、CMV4 表达载体。

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