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ELISA常见问题解析
2015-8-18
来源:互联网
点击数: 2753          作者:未知
  • 一、问:请问对同样培养的相同浓度的细胞,用ELISA检测其上清液相同细胞因子的浓度,不同的报道差别为什么很大?

    参考解析:

    不同厂家的试剂盒当然有很大影响。ELISA非常敏感,即使是同一个试剂盒,用同一个厂家同一浓度的刺激因子,incubate 时间不同也会影响结果,这就是为什么每次都要设内部和外部对照的原因。这主要和其抗体标准品原料来源有关,建议购买ELISA试剂盒时选择大公司提供的产品,这样结果比较可靠一点。

    二、问:ELISA属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育?

    参考解析:

    温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度,也是大多数抗原抗体结合的合适温度

    三、问:检测疫苗免疫小鼠后的抗体情况。用了商品化的试剂盒。
            1、商品化的板子已经用病毒裂解液包被了。
            2、洗3次后,将阳性和阴性血清(猪),样品血清(小鼠)1:40稀释加入,留2个空做空白对照,30分钟37度
            3、洗3次,在一个空白空中加入山羊抗小鼠二抗(1:1000),一个加入商品化已稀释抗猪二抗(不知稀释倍数)。在阳和阴中加入抗猪二抗,样品中加入抗鼠二抗。
            4、洗4次。经加入底物AB侯显色15分钟。终止。测630nm
     结果加入猪二抗的空白空为0.277;阳性为0.964,阴性为0.503% 
           假如鼠二抗的空白空为0.951:个样品都在1.000作用
           请问为什么两个空白空的值差那么多?是不是鼠二抗与包被的病毒抗原结合,还是二抗的稀释倍数不够?或者其他原因?

    参考解析:

    1、首先抗猪二抗和抗鼠二抗本来就是不同的东西(且稀释度不同),在没有非特异性结合出现的情况下,应该是OD值相差无几,但是从现在的结果看,肯定是二抗有非特异性的结合(这一点从加入的样品鼠血清孔鼠二抗空白孔差别不大也可以看出来),故造成两孔OD值差异。

    2、当然这么高的本底也有可能是你的抗体浓度使用稀释度不当或者洗板不彻底(残余大量未结合的酶标抗体)造成的,请首先查明。

    3、不知道你使用的是什么底物进行显色,好像常规ELISA实验的底物是没有检测波长在630nm的。
    排除了2.3两点的问题再考虑是否是二抗不纯并与包被的病毒裂解物结合的问题。

    你加入的商品化稀释的抗猪二抗,却不知道稀释度,这在ELISA实验中是不可取的,酶标抗体的浓度过高必然引起显色本底很高。 你可以取包被的板条不加样品直接加入梯度稀释的酶标记二抗,取OD值在0.1以下时的稀释度再进行检测。若检测值很低则是抗体的敏感性问题,应当更换其它抗体。

    四、问:请教一下,用双夹心ELISA法检测,用菌体免疫的小鼠和家兔,免疫后采集血清,可以直接包被血清吗,还是需要纯化后在包被? 菌体与佐剂乳化时需要无菌操作吗?装血清用无菌操作吗?

    参考解析:

    血清不可以直接包被,主要是因为血清的pH和离子强度与通用的包被液不同,而且会造成一些非特异蛋白质的吸附,不利于特异性抗原或抗体的检测。

    纯化血清的方法很多,一般有盐析法和柱层析法,也可二者联合使用,视对纯度要求不同而异。一般盐析法(比如硫酸铵沉淀)纯化后就可获得主要的免疫球蛋白,而去除其他杂蛋白(如白蛋白等),如果需要进一步纯化的话,还可用凝胶层析法或离子交换层析法来进一步纯化获得IgG,如果抗原足够纯的话,也可以用亲和层析法来做,但这些实验会导致抗体效价的下降和免疫球蛋白的损失,所以要充分衡量利弊再做决定

    五、问:要在balb/c小鼠上,免疫蛋白,做个预实验,elispot检测CTL,elisa检测抗体,我想不加强免疫,在******次免疫一周后,就做能出结果吗?

    参考解析:

    加强免疫只是增加血液中抗体滴度,只是量的增加,理论上不影响定性检测。elisa的敏感性很高,******次免疫后,CTL和抗体都应该能够检测到,但实际操作对实验结果影响很大,具体检测效果如何,你应该试着做做。

    本底及假阳性产生的原因分析

    1、基因工程抗原与合成肽抗原的区别

    基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原,多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点:

    a.分子量大。合成肽采用化学方法制备,由于工艺的局限,合成数量有限,只能达到数百个氨基酸;而利用基因工程制备的抗原,分子量更大。

    引起ELISA测定错误结果的原因主要有:

    (1)标本因素;

    (2)试剂因素;

    (3)操作因素。

    本文就标本因素对ELISA测定的影响做如下讨论。 

    血清是最常用的ELISA标本,血浆一般可视为与血清同等的标本,标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致。

    分为内源性物质和外源性物质两种: 

    1、内源性物质 

    有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质,可以不同程度影响检测结果。

    常见的干扰物质有:类风湿因子、补体、嗜异 性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。 

    (1)类风湿因子 

    人血清中IgM、IgG型类风湿因子(RF)可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合,从而导致假阳性。 

    解决该情况的办法是:

    ①用F(ab)2替代完整的IgG;

    ②标本用联有热变性(63℃,10 min)IgG的固相吸附剂处理(将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效);

    ③检测抗原时,可以用2-巯基乙醇等加入到标本 稀释液中,使RF降解。 

    (2)补体 

     ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程中,抗体分子发生变构,其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来,使C1q 可以将二者连接起来,从而造成假阳性。

    解决的办法是:

    ①用EDTA稀释标本;

    ②用53℃,10 min或56℃,30 min加热血清使C1q灭活。 

    (3)嗜异性抗体 

    人类血清中含有能与啮齿类动物(如鼠等)Ig (s)结合的天然嗜异性抗体,可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来,也能造成假阳性。解决的办法是:可在标本稀释液中加入过量的动 物Ig(s) ,但加入量不足或亚类不同时无效。 

    (4)嗜靶抗原的自身抗体 
         抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体,有时能与靶抗原结合形成复合物,在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。 为避免以上情况出现,解决的办法是:测定前需用理化方法将其解离后再测定。

    (5)医源性诱导的抗鼠Ig (s) 抗体
          临床开展的用鼠源性CD3等单克隆抗体治疗,用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术,均有可能使这些病人体 内产生抗鼠抗体;另外,被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig (s) 抗体。这些病人ELISA测定时均可产生假阳性。解决的办法是:测定抗原时,在标本中加入足量的正常鼠Ig (s) ,从而克服由于上述原因造成的假阳性。 

    (6)交叉反应物质 

    类地高辛、类AFP样物质等,是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大,但在用单克隆抗体测定抗原时 ,如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时,也会出现假阳性结果。 

    (7)标本中其它成分的影响 
           血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等,均对ELISA测定结果有干扰作用。

    2、外源性物质 
           外源性物质常常是由于用于ELISA测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集 不全和采血管中添加物等影响。 

    (1)标本溶血 

    由于各种人为原因引起的标本溶血,均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白,在以辣根过氧化物酶为标记的 ELISA测定中,会导致非特异性显色,干扰测定结果。为克服上述干扰作用,标本采集时必须注意避免溶血。

    (2)标本受细菌污染 

    因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶,因此,被细菌污染的标本同溶血标本一样,亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。 

    (3)标本保存不当 

    在冰箱中保存过久的标本,血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体,在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成 假阳性;标本放置时间过长(如一天以上),有时抗原或抗体免疫活性减弱,亦可出现假阴性。为克服上述干扰,ELISA测定的血清 标本宜为新鲜采集;如不能立即测定,5天内测定的血清标本可存放于4℃,1周后测定的血清标本应低温冻存;冻存后融解的标本,蛋 白质局部浓缩,分布不均,应充分混合后再测定,但混匀时应轻柔,不可强烈振荡。 

    (4)标本凝集不全

    在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下,正常血液采集后1/2~2h开始凝固,18~24h完全凝固。临床检验工作中,有时为了争取 时间快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成 肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果;这类情况于次日复查时因血凝已完全,血清中不再有纤维蛋白原存在,故复查结果变为阴性 。为避免上述干扰作用,解决的办法******是血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清,或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血 管中加入适当的促凝剂。 

    (5)标本管中添加物质的影响 

    抗凝剂(如肝素,EDTA)、酶抑制剂(如NaN3可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性)及快速分离血清的分离胶等均对E LISA测定有一定干扰作用。 综上所述,对临床检验ELISA测定中出现的假阳性或假阴性结果,在考虑试剂因素和操作因素之外,更多的应从标本因素方面进行分析,并应采取相应措施排除干扰作用,从而为临床提供正确可靠的检测结果。

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