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细胞培养常见问题
2015-8-18
来源:互联网
点击数: 3458          作者:未知
  • 1、如何选用特殊细胞系培养基? 

    培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,******MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始,各种目的无血清培养************AIM V(12005)培养基(SFM)。 

    2、 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗? 

    L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。 

    3、GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定? 

    GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。 

    GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。 

    4、什么培养基中可以省去加酚红? 

    酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。 

    酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。 

    5、如何用台盼兰计数活细胞? 

    用无血清培养基把细胞悬液稀释到200~2000个毫升,在0.1毫升的细胞悬液中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。 

    6、 如何消除组织培养的污染? 

    当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。 

    高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。

    下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 

    (1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。 

    (2) 分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mgml。 

    (3)每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。 

    (4)确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2~3代。 

    (5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。 

    (6) 重复步骤4。 

    (7) 在无抗生素的培养基中培养4~6代,确定污染是否以已被消除。 

    7、 培养基中丙酮酸钠的作用是什么? 

    丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。 

    目录上说,Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别? 

    HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2gL)中比在Hanks (0.35gL) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液,。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。 

    8、 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么? 

    二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。 

    我试用SF900 II时,细胞生长良好,但是我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好。 

    如果目的蛋白是一个后期蛋白,它将与蛋白酶一起表达,这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中,这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白,从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中,蛋白酶作用的******底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题,加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清(少于1%),让血清给蛋白酶提供作用底物。 

    9、 20°C下配制的缓冲液,在较高或较低的温度下PH值会改变吗? 

    对于普通使用的缓冲液,PH值随温度变化而变化。 

    下表列出温度改变10℃时,PH值的变化情况: 

    例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-(2x0.310)=6.78 

    缓冲系统

    pKa20℃

    [Delta]pKa10℃

    Mes

    6.15

    -0.110

    Ada

    6.60

    -0.110

    Pipes

    6.80

    -0.085

    Aces

    6.90

    -0.200

    Bes

    7.15

    -0.160

    Mops

    7.20

    -0.013

    Tes

    7.50

    -0.200

    Hepes

    7.55

    -0.140

    Tricine

    8.15

    -0.210

    Tris

    8.30

    -0.310

    Bicine

    8.35

    -0.180

    Glycylglycine

    8.40

    -0.280

    10、 室温下(25)配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用时PH值是多少? 

    缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃时,不同的PH值。 

    4°C

    25°C

    37°C

    8.1

    7.5

    7.2

    8.2

    7.6

    7.3

    8.3

    7.7

    7.4

    8.4

    7.8

    7.5

    8.5

    7.9

    7.6

    8.6

    8

    7.7

    8.7

    8.1

    7.8

    8.8

    8.2

    7.9

    8.9

    8.3

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    8.4

    8.1

    9.1

    8.5

    8.2

    9.2

    8.6

    8.3

    9.3

    8.7

    8.4

    9.4

    8.8

    8.5

    11、昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少? 

    生长培养基的PH值对细胞的增殖和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系,在PH值 6.0~6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时,培养基的最适渗透压是345-380mOsmkg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式,减少技术问题,保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。 

    12、High Five细胞有任何其它名称吗? 

    High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。 

    PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之间有什么差别 

    PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白质的单克隆抗体生产培养基。如果作为杂交瘤生产培养基使用,PFHM-II可能需要补充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM既是杂交瘤生产培养基,也是单克隆抗体生产培养基。它包含低水平的蛋白质。 

    13、在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少? 

    High Five无血清培养基中去污剂的浓度:0.025 gL Tween-80,1.0 gL Pluronic Poly-all。 

    14、High Five细胞用多大的密度冻存? 

    3.0x10E6 cellsml。 

    15、在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀,加热后溶解。它是什么?对我的细胞有害吗? 

    可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解,对实验不会有不利的影响。 

    16、 如何从T25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗? 

    我们强力推荐使用脱落细胞的方法,因为这项技术破坏性最小,生活力******。正如手册上所显示,通过使用巴斯德吸液管,让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在******必要的情况下,才使用胰酶消化细胞。 

    胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞:

    (1)去除培养基。 

    (2)用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞,去除PBS。 

    (3)加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆盖细胞表面)。 

    (4)37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。 

    (5) 向细胞中加入2ml 细胞培养液,移入锥形管,用2ml培养液洗瓶壁,移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。) 

    (6)离心(1100rpm)沉淀细胞。去除培养基。 

    (7)用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 

    17、 在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时,肝素的使用量是多少? 

    为了防止悬浮培养细胞聚集的形成,使用肝素浓度为10单位毫升细胞悬液。 

    在重新冻存sf9细胞前,它可以传多少代?随着传代的次数的增加,它的感染能力会降低吗? 

    通常情况当细胞经过30次传代后,应该返回冻存。无论什么时候计数时,都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍,细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降,它们的感染力将不在是有效的。 

    Tech tips 

    贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能在放置几天后颜色变紫。这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口,在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟,来校正溶液的pH值(确定松开瓶口以保证气体交换)。 

    如果细胞培养基偶然被冻,您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生,培养基可以正常使用,如果出现沉淀,只能丢弃这些培养基。 

    当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下,抗生素不被灭活,可能对于细胞达到毒性水平。 

    一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 

    总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。 

    在进行传代培养时,我们强烈推荐进行台盼兰活性记数。研究者常常通过一个简单的稀释(1∶4或1∶2)进行传代,不进行活性检测,您可能接种比你认为的低的多的浓度的细胞,这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长。 

    在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解,如果在室温下放置超过30分钟,就会变得不稳定。

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